Υπό τον ισπανικό έλεγχο, η Φλόριντα έγινε βάση για περαιτέρω εξερεύνηση και αποικισμό στην Αμερική. Οι Ισπανοί κατακτητές χρησιμοποίησαν τη Φλόριντα ως ορμητήριο για αποστολές σε άλλα μέρη του Νέου Κόσμου, συμπεριλαμβανομένου του Μεξικού και του Περού. Οι Ισπανοί ίδρυσαν επίσης αποστολές στη Φλόριντα για να προσηλυτίσουν τον γηγενή πληθυσμό στον καθολικισμό.
Παρά τις πρώτες αυτές προσπάθειες, ο έλεγχος της Ισπανίας στη Φλόριντα ήταν περιορισμένος. Η περιοχή ήταν αραιοκατοικημένη και οι ισπανικοί οικισμοί ήταν συχνά ευάλωτοι σε επιθέσεις από ιθαγενείς φυλές. Επιπλέον, οι Ισπανοί αμφισβητήθηκαν από τους Γάλλους και τους Άγγλους, οι οποίοι είχαν επίσης αξιώσεις στην περιοχή.
Το 1562, οι Γάλλοι ίδρυσαν το Fort Caroline στο σημερινό Τζάκσονβιλ της Φλόριντα. Η γαλλική αποικία ήταν βραχύβια, ωστόσο, καθώς οι Ισπανοί την κατέστρεψαν το 1565. Το 1607, οι Άγγλοι ίδρυσαν το Jamestown στη Βιρτζίνια. Η αγγλική αποικία ήταν πιο επιτυχημένη από τη γαλλική αποικία και τελικά εξελίχθηκε σε μεγάλη δύναμη στην περιοχή.
Μέχρι το τέλος του 17ου αιώνα, ο έλεγχος της Ισπανίας στη Φλόριντα περιοριζόταν σε μεγάλο βαθμό στις παράκτιες περιοχές γύρω από τον Άγιο Αυγουστίνο. Το 1763, η Ισπανία παραχώρησε τη Φλόριντα στη Μεγάλη Βρετανία με αντάλλαγμα την Κούβα, η οποία είχε καταληφθεί από τους Βρετανούς κατά τη διάρκεια του Επταετούς Πολέμου.
